大发平台

jintianshi2023nian8yue26ri xingqiliu,huanyingguanglinbenzhan 

相关文献

CircNT5E acts as a sponge of microRNA-422a to promote glioblastoma tumorigenesis

文字:[大][中][小] 2018/11/8     浏览次数:    

CircNT5E acts as a sponge of microRNA-422a to promote glioblastoma tumorigenesis

CircNT5E充当microRNA-422a的海绵,以促进胶质母细胞瘤的肿瘤发生

 

    期刊:Cancer Research;影响因子:9.130

    发表单位:创伤性脑损伤与神经病学研究所

 


导读

 

    之前我们介绍了circRNA作为海绵吸附miRNA发挥作用如《》、《》,本研究发现胶质母细胞瘤中circNT5E可以海绵吸附miR-422a,通过影响miR-422a-NT5ESOX4PI3KCA通路促进胶质母细胞瘤细胞增殖,迁移和侵袭等。

 


摘 要

 

    我们确定了miR-422a下调的胶质母细胞瘤组织中特异性增加的circRNAlncRNA的子集。表征了来自NT5EcircRNA,命名为circNT5EcircNT5E控制多种病理过程,包括细胞增殖,迁移和侵袭。circNT5E直接结合miR-422a并抑制miR-422a活性。



背景介绍

 

    胶质母细胞瘤(GBM)是众所周知的中枢神经系统最常见的原发侵袭性恶性脑肿瘤,也是人类最致命的致癌形式之一。在最大可行的手术切除后,接受放疗和替莫唑胺化疗的患者显示平均总生存期约为15个月。因此,GBM迫切需要新的治疗方法,特别是那些靶向复杂基因调控网络的方法。

 


结 果


1   GBM组织中的circRNAlncRNAmRNA分析以及circNT5E表征

    首先,我们分析3对GBM组织样品证实MiR-422a表达低于正常脑组织,然后进行微阵列(circRNAlncRNAmRNA)测定,qRT-PCR验证。图1A显示了不同染色体中上调和下调的circRNAlncRNAmRNA的概述。548circRNA/lncRNA上调。筛选miR-422a调节的ceRNA的流程如图1C。结合阵列数据,TargetScan预测,得到355circRNAs/lncRNAs可作为miR-422a海绵。具有miR-422a的两个或更多个靶位点鉴定了38circRNA/lncRNA。我们通过使用生物素-miRNA下拉法测试这38circRNA/lncRNAqRT-PCR结果显示8lncRNA8circRNA具有良好的特异性和重复性。如图1D所示,与对照组相比,hsa_circ_0077232显示出高倍数变化。因此,我们选择了hsa_circ_0077232进行进一步分析(注意:本研究关注MiR-422a的ceRNA机制分子,为了获得分子,先用芯片/测序筛选差异表达的circ/lncRNA,而后软件预测,取可信度高的(超过两个结合位点),miRNA pulldown验证结合的分子。我们通常是先做测序筛选分子,而后预测结合的miRNA。本研究从相反角度寻找,思路新颖,值得学习。同时我们可以想像重要的miRNA极有可能通过ceRNA结合lnc/circ发挥作用的)

    hsa_circ_0077232(circNT5E)位于染色体6中,长度为2,950个碱基对(bp),由来自NE5E基因组的7个外显子(外显子3-9)组成。Sanger测序证实circNT5ERT-PCR产物中的头对尾剪接具有预期的大小(图1G)。用RNase R消化抗性证实该RNA种类是环状的(图1I)。FISH证明circNT5E优先定位于细胞质中(图1J)。

 


2   CircNT5E影响GBM的增殖,凋亡,迁移和侵袭能

    我们使用FISH检测观察到随着临床分期的增加,circNT5E的表达水平显著增加,同时qRT-PCR测定显示,肿瘤组织中circNT5E表达显著高于正常组织。表明circNT5E在胶质瘤中起着致癌基因的作用。我们选择U87(circNT5E低表达)和U251circNT5E高表达)细胞系进行分析。构建慢病毒载体circNT5ELV-circNT5E),LV载体,LV-si-circNT5ELV杂乱,建立稳定的转染子。qRT-PCR分析显示,在U87-circNT5E稳定细胞系中,circNT5E增加了99.04倍,而与对照细胞系相比,在U251-si-circNT5E稳定细胞系中circNT5E减少了77%。circNT5E的上调显著促进U87细胞的生长,增殖,侵袭和迁移,抑制细胞凋亡同时circNT5E的敲低显著抑制U251细胞生长,增殖,侵袭和迁移并促进细胞凋亡

 


3   CircNT5E促进体内GBM肿瘤形

    我们进一步研究了circNT5E对体内调节肿瘤生长的影响。与LV-载体组相比,在LV-circNT5E组中观察到肿瘤大小和重量增加。IHC染色显示,circNT5E增加了基质金属蛋白酶(MMP-9EGFR的表达。此外,与LV-scrambled组相比,在LV-si-circNT5E组中观察到肿瘤尺寸和重量减少。通过circNT5E敲低抑制MMP-9EGFR。总之,结果证明circNT5E有效地促进体内GBM肿瘤形成

 


4   CircNT5E受RNA编辑酶ADARB2的调节

    在许多先前的研究中已经鉴定出有助于circRNA生物发生的蛋白质因子,例如QuakingRNA结合基序蛋白20RNA编辑酶ADAR。然而,在GBM进展中导致circRNA生物发生的因素尚不清楚。我们专注于RNA结合蛋白,发现特定的富含脑的RNA编辑酶ADARB2GBM组织中被下调(图5A)。在我们的临床样本实验中,发现GBM组织中的ADARB2 mRNA低于正常脑组织(图5B)。然而,出乎意料地,蛋白质印迹分析显示,GBM组织中ADARB2的蛋白质水平高于正常脑组织(图5C)。IHC结果还证实,ADARB2的蛋白质表达水平在肿瘤组织中高于ANT(图5D)。我们构建了ADARB2过表达质粒。结果显示,在具有ADARB2异位表达的U87细胞中,circNT5E的表达水平上调,而线性NT5E mRNA下调(图5GH)。这些结果表明ADARB2参与GBMcircNT5E的生物合成。(注意:此处实验发现mRNA水平与蛋白质水平成相反的趋势,有时候发现mRNA与蛋白质表达不一致或许也是可以理解的)

 

5   CircNT5E可作为GBM中高效的miR-422a海绵

    我们确定在ceRNA筛选试验中可以通过生物素-miR-422a下调circNT5E。其次,我们搜索了circRNADB,这是一个带有蛋白质编码注释的人类环状RNA的综合数据库,没有发现circNT5E的结果。第三,circNT5EGBM细胞的细胞质中丰富且稳定。基于这些发现,我们预测长度为2,950 bpcircNT5E可作为miRNA的结合平台,而不仅仅是miR-422a。正如TargetScan 6.2PubMed搜索“miRNA [AND]胶质母细胞瘤”所预测的那样,我们发现20个与circNT5E相关的miRNA的结合位点(图6A)。几乎所有miRNA都是先前已描述的GBM相关肿瘤抑制剂。荧光素酶基因实验显示15种miRNA,特别是miR-422a,表现出下调的表达(图6B)。这些结果表明circNT5E直接结合miR-422a并抑制其活性。

 


6   CircNT5E通过miR-422a影响GBM细胞的增殖,凋亡,侵袭和迁移能力

    我们通过充当miR-422a的海绵进一步检查了circNT5E是否作为致癌基因起作用。构建过表达敲低细胞。结果表明,miR-422a逆转了circNT5E对细胞活力,增殖,侵袭和迁移的促进作用以及circNT5EGBM细胞凋亡的抑制作用。基于这些结果,circNT5E至少部分地通过miR-422a影响GBM细胞的增殖,凋亡,侵袭和迁移能力。此外,我们通过蛋白质印迹分析验证了circNT5E/miR-422a调节轴对其下游信号传导通路的影响。结果表明,circNT5E在处理的GBM细胞中上调NT5E,SOX4PI3KCAp-Aktp-Smad2水平,而circNT5E敲低下调NT5ESOX4PI3KCAp-Aktp-Smad2水平(注意:qPCR,WB验证那些基因?验证靶基因)。此外,我们还通过miR-124证实了circNT5E调节的CDK4和AURKA。总之,ADARB2蛋白过表达可逆转ADAR1诱导的circNT5E抑制,其通过调节miR-422a-NT5E,SOX4PI3KCA信号传导通路影响GBM细胞的存活,增殖,迁移和侵袭。(注意:如何关联通路?验证通路重要的基因,基因变化了,通路就影响了)。

 


讨 论

    本研究的主要发现如下:(1)我们确定了GBM肿瘤发生中的circRNA/lncRNA表达谱。(2)筛选显示miR-422a的海绵,circNT5E,其调节GBM细胞增殖,侵袭和迁移。(3)我们表征并功能评估了circNT5E是否由NT5E基因组形成并由RNA编辑酶ADARB2调节。(4)我们的研究结果表明,circNT5E通过海绵GBM抑制因子miRNA发挥额外的调节功能。总之,这些结果为开发GBM的新型治疗方法提供了见解。


    上海生因生物专业提供基因组测序、微生物测序、转录组测序(RNAseq),高通量测序数据标准分析、个性化分析,各类图表绘制,及GEOTCGA数据挖掘服务。有需要的联系我们。


微信扫描二维码关注公众号回复数字 “1810301” 下载文献原文及译文



其他相关文献解读

返回上一步
打印此页
在线咨询
咨询QQ咨询QQ
咨询电话:
400-966-5216

qingsaomiaoerweimatianjiakefuweixin

公众号

[向上]
云顶集团-(中国)搜狗百科 完美体育 【更懂彩民!】 龙8国际 (中国)网络百科 大发彩票 -词条百科 半岛彩票 -百科大全