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Non-coding RNAs participate in the regulatory network of CLDN4 via ceRNA mediated miRNA evasion

文字:[大][中][小] 2018/10/25     浏览次数:    

Non-coding RNAs participate in the regulatory network of CLDN4 via ceRNA mediated miRNA evasion

非编码RNA通过ceRNA介导的miRNA逃避参与CLDN4的调节网络


期刊NATURE COMMUNICATIONS;影响因子:12.353

发表单位:中国医科大学附属第一医院                                            


导 读


    大多老师通过芯片或者测序获得了差异表达的lncRNA,此时想研究其ceRNA机制。一般逻辑是找到差异lncRNA,接下来预测结合的miRNA,再预测miRNA结合的靶基因。可是或许会发现一个问题,这个lncRNA在本研究中确是发挥重要作用吗?如果验证了差异lnc,也可能找不到合适的miRNA及有效的靶基因。lncRNAmiRNA是调节分子,其作用依赖于靶基因的功能。正常找分子的思路应该是先找到有效的靶基因(该基因在此过程中发挥重要作用,他的变化,会影响整个过程),而后预测可以结合并抑制他的miRNA,进而倒推哪些lncRNA可以结合miRNA。本研究是一个很好的例子。 ;                                                                        

摘 要


    本研究,我们发现了一种调节胃癌中Claudin-4的网络。我们观察到Claudin-4在胃癌中上调并且与预后不良有关。Claudin-4可增强AGS,HGC-27和SGC-7901细胞的增殖,侵袭和EMT,这可被miR-596和miR-3620-3p逆转。此外,lncRNA-KRTAP5-AS1和lncRNA-TUBB2A可以作为竞争性内源RNA来影响Claudin-4的功能。我们的结果表明,非编码RNA在Claudin-4的调控网络中发挥重要作用。                                         ;   

介 绍

    胃癌(GC)是最常见的癌症之一,在世界范围内死亡率很高。转移是许多复杂过程的最终结果,是临床实践中的一项重大挑战。越来越多的证据揭示了miRNA在癌基因和肿瘤抑制基因的转录后调控中不可或缺的功能,从而调节肿瘤细胞的生物学行为,如侵袭,转移,增殖和凋亡有趣的是,最近的一些研究报告了一种全新的lncRNAs调控通路,其中lncRNA可以作为竞争性内源RNAceRNA)发挥作用,并通过竞争性结合其常见的miRNAmRNA发生串扰。                                                     

结 果

1

CLDN4被鉴定为miR-596和miR-3620-3p的靶标

    为了鉴定GC中mRNAncRNA的调节网络,使用Human LncRNA+mRNA Arrayv3.0以及miRCURY LNATM microRNA Array通过微阵列分析六对GC组织和癌旁组织。总共发现235个miRNAGC和非肿瘤邻近组织之间差异表达,包括173个上调,62个下调超过2倍。共发现4329个lncRNA显著差异表达,其中1974个上调,2355个下调。总共鉴定了3369个差异表达的mRNA,其中1816个上调,1553个下调超过2倍。应用分层聚类以显示miRNAlncRNAmRNA的表达模式(图1a)。根据通路分析结果,我们选择了四种与癌症发展相关的经典通路:“细胞粘附”,“癌症中的通路”,“紧密连接”和“细胞周期”。结合lncRNAmiRNA微阵列结果,在选择这四种通路中的经典基因时进行mRNA-ceRNA分析(图1b)。

    在“紧密连接”通路的mRNA-ceRNA分析结果中,与癌症发展密切相关的CLDN4引起了我们的注意。最初,TargetScan(7.1版)结果显示CLDN4含有预测的miR-596miR-3620-3pmiR-4292靶向位点(图1c)。我们证实了miR-596miR-3620-3pmiR-4292在转录(图1d)和翻译(图1e)水平上可以对CLDN4表达产生负调控。为了测试这些miRNA对基因表达的影响,我们将荧光素酶报告质粒psiCHECK2-CLDN4转染到GC细胞中。过表达miR-596miR-3620-3p,但不是miR-4292miR-596-mutmiR-3620-3p-mutmiR-4292-mutmiRNA阴性对照(miR-NC),降低了psiCHECK2-CLDN4的荧光素酶活性。证明CLDN4是miR-596miR-3620-3p的靶基因


2

CLDN4的体外生物学功能

    为了测试CLDN4的生物学功能并进一步验证其与miR-596miR-3620-3p的结合,我们在SGC-7901AGSHGC-27细胞中稳定过表达CLDN4。通过miR-596miR-3620-3p的异位过表达,可以在转录和翻译水平上克服由稳定转染引起的CLDN4上调。通过进行细胞计数试剂盒-8CCK-8)检测,我们发现与含有空载体pEX-2的平行稳定细胞系相比,CLDN4过表达可显著提高SGC-7901AGSHGC-27细胞的增殖能力(pEX2-NC细胞)。当转染miR-596miR-3620-3p而非miR-596-mutmiR-3620-3p-mut时,可以消除这种增加。CLDN4过表达可以显著提高GC细胞的侵袭能力,当转染miR-596或miR-3620-3p这种增加可以再次部分消除。CCK-8测定显示CLDN4敲低细胞的增殖明显慢于用乱序shRNA转染的平行稳定细胞系。与LV3-sh-NC细胞相比,LV3-sh-CLDN4细胞也显示出减弱的侵袭能力。通过抑制miR-596或miR-3620-3p可以在很大程度上挽救由敲除CLDN4引起的增殖能力和侵袭能力的降低

    我们注意到CLDN4对细胞周期分布或细胞凋亡没有明显影响。令我们惊讶的是,miR-596或miR-3620-3p可以促进细胞凋亡,这表明miRNA的其他靶基因可能有助于这一有趣的结果。然后,为了评估这两种miRNA对细胞增殖和侵袭的影响是否主要依赖于CLDN4,我们将两种miRNA转染到CLDN4敲低细胞中。当CLDN4被敲低时,两种miRNA对细胞增殖和转移几乎没有影响

    我们看到,与pEX2-NC细胞相比,CLDN4的过表达可以降低E-钙粘蛋白和细胞角蛋白的表达,并增强N-钙粘蛋白,β-连环蛋白,Twist1ZEB-2MMP9的表达。正如预期的那样,miR-596miR-3620-3p可以部分消除这些影响


3

CLDN4和miRNA在GC组织中的表达

    为了进一步研究CLDN4在人类GC中的作用,我们在104GC组织和癌旁组织中进行了深度验证。GC组织中CLDN4的转录水平显著更高。对这104名患者使用Kaplan-Meier分析和对数秩检验,我们发现较高的CLDN4表达水平与总体存活率降低显著相关。此外,Cox多变量分析的结果显示,较高的CLDN4表达是GC预后不良的独立预测因子。由于CLDN4已被证明是miR-596miR-3620-3p的靶基因,我们还检测了这些miRNA在相同组织中的表达。miR-596和miR-3620-3p的表达水平在GC组织中均显著较低。这些数据支持GC组织中高CLDN4表达与较差的存活相关并且与miR-596miR-3620-3p的表达负相关


4

LncRNA可通过直接结合与miRNA串扰

    为了鉴定可能与miR-596或miR-3620-3p相互作用并充当ceRNAlncRNA,我们进行了关注前面提到的“紧密连接”网络的实验。在14种候选lncRNA中,lncRNA-KRTAP5-AS1在响应miR-596的过表达时呈现最明显的下调。同时,lncRNA-TUBB2AlncRNA-KRTAP5-AS1的表达在miR-3620-3p过表达后降低最多。为了测试这些调节相互作用的特异性,我们对6种胃癌细胞系进行了RNA测序(过表达miR-596SGC-7901细胞,过表达miR-3620-3pmiRNA阴性对照,过表达lncRNA-KRTAP5-AS1,过表达lncRNA-TUBB2A,或lncRNA阴性对照)。在过表达miR-596的细胞中,CLDN4的表达(FPKM的倍数变化=0.125)和lncRNA-KRTAP5-AS1FPKM的倍数变化=0.760)被下调。此外,CLDN4的表达(FPKM的倍数变化=0.543),lncRNA-TUBB2AFPKM的倍数变化=0.854)和lncRNA-KRTAP5-AS1FPKM的倍数变化=0.280)均下调在与对照组相比过表达miR-3620-3p的细胞中。有趣的是,在过表达lncRNA-KRTAP5-AS1(FPKM的倍数变化=14.168)或lncRNA-TUBB2AFPKM的倍数变化=12.051)的细胞中发现CLDN4表达增加

    LncRNA-KRTAP5-AS1位于11号染色体上,长度为2554个核苷酸,具有5个预测的miR-3620-3p靶向位点和5个预测的miR-596靶向位点。LncRNA-TUBB2A位于染色体6上,长度为1052个核苷酸,具有5个预测的miR-3620-3p靶向位点。我们发现lncRNA-KRTAP5-AS1lncRNA-TUBB2A通过ISH呈现与CLDN4miRNA相同的细胞质定位。荧光素酶实验显示miR-596miR-3620-3p数据显示lncRNA-KRTAP5-AS1可以结合miR-596miR-3620-3p。同时,lncRNA-TUBB2A可以结合miR-3620-3p


5

lncRNA充当ceRNA以在体外调节细胞功能

    为了测试这两种lncRNA的生物学功能,我们在GC癌细胞中进行了功能获得和功能丧失研究。我们在SGC-7901AGSHGC-27细胞中稳定过表达或敲低了lncRNA-KRTAP5-AS1。通过CCK-8测定法测量,LncRNA-KRTAP5-AS1过表达导致增殖能力增加。毫不奇怪,miR-596和miR-3620-3p可以消除由lncRNA-KRTAP5-AS1引起的两种生物学功能。相反,内源性lncRNA-KRTAP5-AS1表达的敲低显著降低了AGS细胞的增殖能力和侵袭能力。如所预期的,miR-596miR-3620-3p的抑制可以再次降低这些效应。

    进行类似的实验以通过在SGC-7901,AGSHGC-27细胞中的稳定过表达和抑制来测试lncRNA-TUBB2A的生物学功能。简而言之,通过CCK-8transwell实验,发现lncRNA-TUBB2A过表达增加了GC细胞的增殖能力和侵袭能力,miR-3620-3p可以部分消除这种作用。相反,抑制miR-3620-3p可以挽救由lncRNA-TUBB2A敲低引起的增殖能力和侵袭能力的降低

    miR-596和miR-3620-3p可以消除CLDN4促进体外细胞增殖和侵袭的能力,并且CLDN4细胞中lncRNA-KRTAP5-AS1lncRNA-TUBB2A的过表达显著进一步提高了这些能力。随后,测量这两种lncRNA的EMT诱导效应。在lncRNA过表达后,上调标志物(E-钙粘蛋白,细胞角蛋白)的下调和由CLDN4诱导的间充质标志物和入侵相关标志物(N-钙粘蛋白,ZEB-2MMP9)的上调被夸大。总之,我们发现通过作为ceRNA调节CLDN4表达,lncRNA-KRTAP5-AS1lncRNA-TUBB2A可以促进细胞增殖,侵袭和EMTLncRNA-KRTAP5-AS1似乎充当miR-596miR-3620-3pceRNA,而lncRNA-TUBB2A充当miR-3620-3pceRNA


6

非编码RNA在体内调节CLDN4的功能

    为了评估这些基因在体内的生物学功能,将不同的SGC-7901HGC-27细胞皮下或静脉内注射到裸鼠中。总共有六组:第1组(pEX2-NC)注射pEX2-NC细胞;2组(CLDN4)注射过量表达CLDN4的细胞;3组(miR-596+CLDN4)注射用miR-596模拟物转染的过表达CLDN4的细胞;4组(miR-3620-3p+CLDN4)注射用miR-3620-3p模拟物转染的CLDN4过表达细胞;5组(lncRNA-KRTAP5-AS1+CLDN4)注射用lncRNA-KRTAP5-AS1转染的CLDN4过表达细胞;注射用IncRNA-TUBB2A转染的CLDN4过表达细胞和第6组(lncRNA-TUBB2A+CLDN4)。我们发现CLDN4组肿瘤肿块明显大于pEX2-NC组,miR-596miR-3620-3p可部分减少CLDN4引起的生长趋势。此外,lncRNA过表达组中的肿瘤体积大于CLDN4过表达组中的肿瘤体积。                                                      

讨 论

    在本研究中,我们发现CLDN4miR-596miR-3620-3p的共同靶标,可以在体外和体内显著增强GC细胞的增殖和侵袭。在外源引入miR-596miR-3620-3p后,CLDN4的这些作用降低。我们还观察到CLDN4,其表达与miR-596miR-3620-3p的表达呈负相关,在GC组织中上调,并且与GC患者的不良存活显著相关。与上述miRNACLDN4的抑制作用相反,我们的结果显示外源性引入lncRNA-KRTAP5-AS1lncRNA-TUBB2A可以提高CLDN4对增殖和侵袭的作用。所有这些结果促使我们建议存在一个值得注意的调控网络,其中miRNAlncRNA相互作用以共同调节CLDN4的表达模式和功能(图10)。

    有报道LncRNA-ARSR可以充当miR-34miR-449ceRNA以促进AXLc-MET表达,从而促进肾细胞癌中的舒尼替尼抗性。在这里,我们显示lncRNA-KRTAP5-AS1通过结合miR-596miR-3620-3p在体外充当致癌基因,并且lncRNA-TUBB2A通过结合miR-3620-3p起作用。这表明这两种lncRNA可以作为ceRNAs。随后的研究如荧光素酶活性测定,基于Ago2RIP和体内实验进一步证实这两种lncRNA作为ceRNA调节CLDN4



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